مجله علوم پزشکی پارس

اثرحذف ژن موثر در بروز سرطان UCA1 با روش نوین ویرایش ژنی CRISPR/Cas9 در رده سلولی سرطان تخمدان

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاداسلامی، شهرکرد، ایران

2 دانشیار، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

3 استادیار، گروه پزشکی مولکولی، دانشکده فناوری‌های‌ پیشرفته پزشکی،دانشگاه‌ علوم پزشکی ایران ، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: lncRNA ها در رشد، رونویسی، ترجمه و آپوپتوز سلول نقش دارند. UCA1 نوعی lncRNA مهم است که با پیشرفت سرطان تخمدان ارتباط دارد. بیش از نیمی از زنان مبتلا به سرطان تخمدان در کمتر از پنج سال بعد از تشخیص از بین می روند. هدف از پژوهش حاضر حذف ژن UCA1 (Urothelial Carcinoma Associated 1) با استفاده از روش پیشرفته CRISPR /Cas9 در سلول SK-OV-3 و تعیین اثر آن بر پیشرفت سرطان و آپوپتوز بود. 
روش­ کار: ابتدا با نرم افزار CHOPCHOP، دو نوع sgRNA‌ برای UCA1 طراحی شد. این sgRNA‌ ها پس از سنتز، در دو وکتور pSCas9 به صورت جداگانه کلون شدند. سلول­ های SK-OV-3 نیز با دو وکتور حامل sgRNA‌ها، ترانسفکت شدند. پس از تایید عملکرد صحیح CRISPR در این سلول­ ها، بیان ژن­ های BAK ، BAX, P53 و FAS  و آنتی‌آپوپتوزی BCL2 و survivin به روش Real time PCR ارزیابی شد. همچنین میزان تکثیر سلولی و آپوپتوز با متیل تیازول تترازولیوم (MTT) و فلوسیتومتری بررسی شد.
یافته ها: نتایج نشان دهنده حذف موفق ژن UCA1 در رده سلولی SK-OV-3 بود. بیان ژن­ های BAK، BAX, P53 و FAS در سلول­ های دستورزی شده نسبت به سلول­ های شاهد، به صورت معناداری افزایش بیان نشان داد (0.05>p). همچنین، کاهش بیان ژن­ های BCL2 و survivin در سلول­ های دچار حذف ژن نسبت به گروه شاهد مشاهده شد (0.05>p). نتایج MTT و فلوسیتومتری حاکی از کاهش تکثیر سلولی و افزایش آپوپتوز بود. 
نتیجه­ گیری: حذف ژن UCA1 در سلول SK-OV-3، اثرات مثبت در کاهش تکثیر و افزایش آپوپتوز نشان داد، از این رو جلوگیری از بیان این ژن نقش موثری در کنترل رشد سلول­ های سرطان تخمدان دارد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of the effects of UCA1 gene knockout with a new CRISPR/Cas9 gene editing technique in ovarian cancer cell line

نویسندگان [English]

  • Behshad Montazeri-Najafabadi 1
  • Abbas Doosti 2
  • Jafar Kiani 3

1 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran

2 Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran

3 Department of Molecular Medicine, Faculty of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences (IUMS), Tehran, Iran

چکیده [English]

Introduction: lncRNAs play their roles in cell growth, transcription, translation, and apoptosis. UCA1 is a type of lncRNA has a direct relationship with ovarian cancer. More than half of the women with ovarian cancer die within less than five years from the disease diagnosis. This study aims to knockout of UCA1 gene using the CRISPR/Cas9 technique in SK-OV-3 cell and studying its effect on cell factors involved in cancer progress and apoptosis.
Materials and Methods: Two types of sgRNAs for UCA1 gene were designed. sgRNAs were cloned after synthesis in two
vectors of PX459. The SK-OV-3 cell was transfected with two vectors carrying sgRNAs. The expression of FAS, BAK, BAX, and P53 pro-apoptosis genes and BCL2 and SURVIVIN anti-apoptosis genes were evaluated using the q-PCR. Besides, the cell proliferation rate and apoptosis induction were studied using MTT and flowcytometry.
Results: The result showed the successful knockout of the UCA1 gene in the SK-OV-3 cell line. The expression of FAS, BAK, BAX, and P53 genes showed a meaningful increase related to the expression in manipulated cells compared to control cells (p˂0.05). Also, the expression decrease of BCL2 and SURVIVIN genes was seen (p˂0.05). MTT and flow cytometry results confirmed the cell proliferation decrease and the apoptosis increase.
Conclusion: UCA1 gene Knockout in the SK-OV-3 showed some positive effects in decreasing cancer cell proliferation and increasing the apoptosis rate can be said that inhibiting overexpression of the UCA1 gene will play a positive role in controlling the growth of ovarian cancer cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • UCA1
  • Ovarian Cancer
  • CRISPR/CAS9
1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018; 68(6):394–424. 2. Torre LA, Trabert B, DeSantis CE, Miller KD, Samimi G, Runowicz CD, Gaudet MM, Jemal A, Siegel RL. Ovarian cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin. 2018; 68(4):284-296. 3. Lheureux, S, Braunstein M, Oza AM. Epithelial ovarian cancer: Evolution of management in the era of precision medicine. CA Cancer J Clin. 2019; 69(4):280-304. 4. Grillone K, Riillo C, Scionti F, Rocca R, Tradigo G, Guzzi PH, Alcaro S, Di Martino MT, Tagliaferri P, Tassone P. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter". J Exp Clin Cancer Res. 2020; 39(1):117. 5. Wang WT, Han C, Sun YM, Chen TQ, Chen YQ. Noncoding RNAs in cancer therapy resistance and targeted drug development. J Hematol Oncol. 2019; 12(1):55. 6. Zhan L, Li J, Wei B. Long non-coding RNAs in ovarian cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2018; 37: 120. 7. Renganathan A, Felley-Bosco E. Long Noncoding RNAs in Cancer and Therapeutic Potential. Adv Exp Med Biol. 2017; 1008:199-222. 8. Saliminejad K, Khorram Khorshid HR, Soleymani Fard S, Ghaffari SH. An overview of microRNAs: Biology, functions, therapeutics, and analysis methods. J Cell Physiol. 2019; 234(5):5451-5465. 9. Zhang S, Dong X, Ji T, Chen G, Shan L. Long non-coding RNA UCA1 promotes cell progression by acting as a competing endogenous RNA of ATF2 in prostate cancer. Am J Transl Res. 2017;9(2):366–75. 10. Huang J, Zhou N, Watabe K, Lu Z, Wu F, Xu M, et al. Long non-coding RNA UCA1 promotes breast tumor growth by suppression of p27 (Kip1). Cell Death Dis. 2014;5(1):e1008–e1008. 11. Han Y, Yang YN, Yuan HH, Zhang TT, Sui H, Wei XL, et al. UCA1, a long non-coding RNA up-regulated in colorectal cancer influences cell proliferation, apoptosis and cell cycle distribution. Pathology. 2014;46(5):396–401. 12. Communications R. Downregulation of lncrna uca1 as a diagnostic and prognostic biomarker for ovarian endometriosis. 2019;65(216):336–41. 13. Alberto-Aguilar DR, Hernández-Ramírez VI, Osorio-Trujillo JC, Gallardo-Rincón D, Toledo-Leyva A, Talamás-Rohana P. Ascites from Ovarian Cancer Induces Novel Fucosylated Proteins. Cancer Microenviron. 2019; 12(2-3):181-195. 14. Lu Y, Huang M, Deng T, Zhou X, Yu K, Liang M, Deng L, Xue J, Yi X, Ding Z, Gong Y, Zhu J, Wang Y, Wang Y, Song J, Tong R, Li L, Huang J, Na F, Zhao M, Chen C, Wei Y, Li W. Abstract CT133: a phase I trial of PD-1 deficient engineered T cells with CRISPR/Cas9 in patients with advanced non-small cell lung cancer with PD-L1 expression. Cancer Res., 2018; 78 (13 Supplement): CT133-CT133. 15. Adli M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Commun. 2018; 9(1):1911. 16. Maddams J, Utley M, Møller H. Projections of cancer prevalence in the United Kingdom, 2010-2040. Br J Cancer. 2012;107(7):1195–202. 17. Yan Y, Chen Y, Jia H, Liu J, Ding Y, Wang H, et al. Patterns of life lost to cancers with high risk of death in China. Int J Environ Res Public Health. 2019;16(12):1–19. 18. Wang CJ, Zhu CC, Xu J, Wang M, Zhao WY, Liu Q, Zhao G, Zhang ZZ. The lncRNA UCA1 promotes proliferation, migration, immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs. Mol Cancer. 2019 Jul 4;18(1):115. doi: 10.1186/s12943-019-1032-0. 19. Wang X, Peng F, Cheng L, Yang G, Zhang D, Liu J, et al. Prognostic and clinicopathological role of long non-coding RNA UCA1 in various carcinomas. Oncotarget. 2017;8(17):28373–84. 20. Chen P, Wan D, Zheng D, Zheng Q, Wu F, Zhi Q. Long non-coding RNA UCA1 promotes the tumorigenesis in pancreatic cancer. Biomed Pharmacother [Internet]. 2016;83:1220–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biopha.2016.08.041 21. Qin L ting, Tang R xue, Lin P, Li Q, Yang H, Luo D zhong, et al. Biological function of UCA1 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance: Investigation with in vitro and meta-analysis. Pathol Res Pract [Internet]. 2018;214(9):1260–72. Available from: https://doi.org/10.1016/j.prp.2018.03.025 22. Jiao C, Song Z, Chen J, Zhong J, Cai W, Tian S, et al. LncRNA-UCA1 enhances cell proliferation through functioning as a ceRNA of Sox4 in esophageal cancer. Oncol Rep. 2016;36(5):2960–6. 23. Yang Y, Jiang Y, Wan Y, Zhang L, Qiu J, Zhou S, et al. UCA1 functions as a competing endogenous RNA to suppress epithelial ovarian cancer metastasis. Tumor Biol [Internet]. 2016;37(8):10633–41. Available from: http://dx.doi.org/10.1007/s13277-016-4917-1 24. Wang J, Ye C, Liu J, Hu Y. UCA1 confers paclitaxel resistance to ovarian cancer through miR-129/ABCB1 axis. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2018;501(4):1034–40. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.05.104 25. Zhang L, Cao X, Zhang L, Zhang X, Sheng H, Tao K. UCA1 overexpression predicts clinical outcome of patients with ovarian cancer receiving adjuvant chemotherapy. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;77(3):629–34. 26. Campos-Parra AD, López-Urrutia E, Moreno LTO, López-Camarillo C, Meza-Menchaca T, Figueroa González G, et al. Long non-coding RNAs as new master regulators of resistance to systemic treatments in breast cancer. Int J Mol Sci. 2018;19(9). 27. Li Z, Niu H, Qin Q, Yang S, Wang Q, Yu C, et al. lncRNA UCA1 Mediates Resistance to Cisplatin by Regulating the miR-143/FOSL2-Signaling Pathway in Ovarian Cancer. Mol Ther - Nucleic Acids [Internet]. 2019;17(September):92–101. Available from: https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.05.007 28. Fang Z, Zhao J, Xie W, Sun Q, Wang H, Qiao B. LncRNA UCA1 promotes proliferation and cisplatin resistance of oral squamous cell carcinoma by sunppressing miR-184 expression. Cancer Med. 2017;6(12):2897–908.
مجله علوم پزشکی پارس
دوره 19، شماره 1 - شماره پیاپی 55
فروردین 1400
صفحه 10-20