همسانه سازی، بهینه سازی شرایط بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب Nef-MPER-V3 ویروس HIV-1 در سیستم بیانی پروکاریوتی

نویسندگان
احمد فقیه 1
سید مهدی سادات 2
اعظم بوالحسنی 3
شیوا ایرانی 4
1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
2 دانشیار ژنتیک مولکولی، بخش هپاتیت، ایدز و ویروس های منتقله از خون، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران
3 دانشیار ،بخش هپاتیت،ایدزو ویروس های منتقله از خون، انستیتوپاستور ایران،تهران، ایران
4 دانشیار ژنتیک مولکولی،دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات،تهران، ایران
10.52547/jmj.17.2.46
چکیده
مقدمه: پروتئین تنظیمی Nef و همچنین  پروتئین های ساختاری MPER و V3 ویروس HIV-1 از اهداف مهم در مطالعات واکسن به شمار می روند. از این رو در مطالعه حاضر، پروتئین فیوژن Nef-MPER-V3 در سیستم بیانی پروکاریوتی کلون و بیان شد تا به عنوان کاندید مناسب در مطالعات آتی واکسن مورد ارزیابی قرار گیرد.
روش کار: توالی ژن Nef-MPER-V3  سنتز و توسط آنزیم های NotI /HindIII به داخل وکتور pET-28a الحاق شد. سپس، بیان پروتئین نوترکیب در سیستم بیانی BL21(DE3) انجام شد. به منظور بهینه سازی بیان، فاکتورهایی نظیر زمان القاء، غلظت IPTG و دانسیته نوری (OD) مورد ارزیابی قرار گرفت. پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون  Ni-NTA agarose تخلیص و با استفاده از SDS-PAGE 12% ارزیابی شد و نهایتا، توسط وسترن بلات تایید شد.
یافته ها: ژن هدف با موفقیت در وکتور بیانی کلون شد. بهترین شرایط بیان شامل: 2 میلی مولار IPTG، کدورت نوریOD600nm=0.7  و  رشد به مدت پنج ساعت پس از القاء تعیین شد. پروتئین نوترکیب به وسیله کروماتوگرافی تمایلی تحت شرایط دناتوره و با استفاده از اوره  با غلظت حدود 300 میکروگرم در میلی لیتر تخلیص شد. پروتئین فیوژن تخلیص شده به صورت یک باند واضح حدود 35 کیلودالتون در SDS-PAGE مشاهده و با استفاده از آنتی بادی ضد Nef در وسترن بلات آشکار شد.
 نتیجه گیری: نتایج نشان داد که پروتئین نوترکیب NEF-MPER-V3 در سیستم بیانی BL21 (DE3)  به خوبی بیان شده و پروتئین تخلیص شده قابلیت استفاده در آزمایش های آتی به منظور ارزیابی ایمنوژنسیتی آن در موش که در حال انجام می باشد را دارد.
 
کلیدواژه‌ها
HIV-1
Nef-MPER-V3
کروماتوگرافی تمایلی
پروتئین نوترکیب
بیان ژن

عنوان مقاله English

Cloning, Optimization of Expression Condition and Purification of the Recombinant Nef- MPER-V3 Protein of HIV-1 in Prokaryotic Expression System

نویسندگان English

Ahmad Faghih 1
Seyed Mehdi Sadat 2
Azam Bolhassani 3
Shiva Irani 4
1 MSc, Department of Biology, Sciences and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Associate prof., Department of Hepatitis, AIDS and Blood borne diseases, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3 Associate prof., Department of Hepatitis, AIDS and Blood borne diseases, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
4 Associate prof., Department of Biology, Sciences and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده English

Introduction: Neff regulatory protein as well as structural proteins such as MPER and V3 of HIV-1 is important targets in vaccine studies. Therefore, in the current study, the Nef-MPER-V3 fusion protein was cloned and expressed in prokaryotic expression system that will be evaluated as a candidate for future vaccine studies.
Materials and Methods: The Nef-MPER-V3 sequence was synthesized and inserted into pET-28a(+) vector using Not I/HindIII enzymes. Then, the recombinant construct was expressed in BL21 (DE3) strain of E.coli. For optimization of protein expression, several factors such as time of induction, IPTG concentration and optical density (OD) were evaluated. The recombinant protein was purified on a Ni-NTA agarose column and analyzed by 12% SDS-PAGE. Finally, the fusion protein was confirmed by western blotting.
Results: The target gene was successfully cloned into the recombinant vector. The best condition for the expression such as; 2 m IPTG, OD600 = 0.7 and growth 5 hours post-induction were determined and the recombinant protein was purified by affinity chromatography in denaturing condition with urea at a concentration of about 300 μg/ ml. The purified fusion protein migrated as a clear band of around 35 kDa in SDS-PAGE and was detectable using anti-Neff antibody in western blotting.
Conclusion: Our results showed that the Nef-MPER-V3 protein was successfully expressed in prokaryotic system and purified protein may provide the antigen for future experiments for immunogenicity evaluation in mice is currently undertaken.

کلیدواژه‌ها English

HIV-1
Nef-MPER-V3
Affinity chromatography
Recombinant protein
Gene expression
1. Yanik EL, Katki HA, Engels EA. Cancer risk among the HIV-infected elderly in the United States. AIDS. 2016; 30(10):1663-1668. 2. UNAIDS, 2019. Global HIV & AIDS statistics. http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet.; 2019. 3. Turpin JA. The next generation of HIV/AIDS drugs: novel and developmental anti HIV drugs and targets. Expert Rev Anti Infect Ther. 2003; 1(1):97-128. 4. Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Annu Rev Immunol. 2000; 18(1):927-974. 5. Modrow S, Hahn BH, Shaw GM, Gallo RC, Wong-Staal F, Wolf H. Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiency virus isolates: prediction of antigenic epitopes in conserved and variable regions. J Virol. 1987; 61(2): 570-578. 6. Starcich BR, Hahn BH, Shaw GM, McNeely PD, Modrow S, Wolf H, et al. Identification and characterization of conserved and variable regions in the envelope gene of HTLV-III/LAV, the retrovirus of AIDS. Cell 1986; 45(5): 637-648. 7. Rajarapu G. Genes and Genome of HIV-1. J Phylogen Evolution Biol. 2013; 2:126. 8. Gach JS, Leaman DP, Zwick MB. Targeting HIV-1 gp41 in close proximity to the membrane using antibody and other molecules. Curr Top Med Chem. 2011; 11(24):2997-3021. 9. Gamble, L.J. and Q.L. Matthews, Current progress in the development of a prophylactic vaccine for HIV-1. Drug Des Devel Ther, 2010. 5: 9-26. 10. Tohidi F, Sadat SM, Bolhassani A, Yaghobi R, Larijani MS. Induction of a Robust Humoral Response using HIV-1 VLPMPER-V3 as a Novel Candidate Vaccine in BALB/c Mice. Curr HIV Res. 2019; 17(1):33-41. 11. Burton D.R., et al. HIV vaccine design and the neutralizing antibody problem. Nat. Immunol. 2004; 5(3): 233-236. 12. Hou P, Chen S, Wang S, Yu X, Chen Y, Jiang M, et al. Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection. Sci rep 2015; 5:15577. 13. Didigu CA, Wilen CB, Wang J, Duong J, Secreto AJ, Danet-Desnoyers GA, et al. Simultaneous zinc-finger nuclease editing of the HIV coreceptors ccr5 and cxcr4 protects CD4+ T cells from HIV-1 infection. Blood. 2014; 123(1):61-9. 14. Pantophlet R،Wrin T،Cavacini LA. Neutralizing activity of antibodies to the V3 loop region of HIV-1 gp120 relative to their epitope fine specificity.Virology. 2008; 381(2):251-260. 15. Jafarzade BS, Sadat SM, Yaghobi R, Bolhassani A. Reverse staining: Effective method for purification of HIV-1 Nef protein in prokaryotic expression system. Feyz. 2016; 20(5):420-426.(Persian) 16. Collins KL, Chen BK, Kalams SA, Walker BD, Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. Nature 1998; 391(6665):397-401. 17. Hokey DA, Weiner DB. DNA vaccines for HIV: challenges and opportunities. Springer Semin Immunopathol 2006; 28(3):267-79. 18. Kilpeläinen A, Axelsson Robertson R, Leitner T, Sandström E, Maeurer M, Wahren B. HIV-1 Nef protein carries multiple epitopes suitable for induction of cellular immunity for an HIV vaccine in Africa. AIDS Res Hum Retroviruses 2014; 30(11):1065-71. 19. Cosma A, Nagaraj R, Bühler S, Hinkula J, Busch DH, Sutter G, et al. Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nef-specific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals. Vaccine 2003; 22(1):21-9. 20. Mierendorf RC, Morris BB, Hammer B, Novy RE. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Methods Mol Med. 1998; 13:257-92. 21. Kumar M, Kaur S, Nazir A, Tripathi RK. HIV-1 Nef binds with human GCC185 protein and regulates mannose 6 phosphate receptor recycling. Biochem Biophys Res Commun 2016;474(1):137-145. 22. Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Front Microbiol. 2014;5:172. 23. Parzych EM, Miura K, Ramanathan A, Long CA, Burns JM Jr. Evaluation of a Plasmodium-specific carrier protein to enhance production of recombinant Pfs25, a leading transmission-blocking vaccine candidate. Infect Immun 2017;86(1). 24. Jiang XY, Wang CF, Zhang PJ, He ZY. Cloning and expression of Mycobacterium bovis secreted protein MPB83 in Escherichia coli. J Biochem Mol . 2006;39(1):22-5. 25. Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif 2005;41(1):98-105. 26. Harris, ELV, Angal S. Protein purification methods. New York, NY: Oxford University Press; 1989.