مجله علوم پزشکی پارس

مقایسه دو روش PCR مستقیم و PCR با استفاده ازDNA استخراج شده توسط کیت در تعیین ژنهای tst و mecA در باکتری استافیلوکوک اورئوس

نویسندگان

دانشگاه علوم پزشکی زاهدان

چکیده

چکیده:

مقدمه: انجام واکنش PCR یکی از دقیق ترین و حساس ترین تست ها برای سنجش های مولکولی می باشد. استخراج DNA همیشه از وقت گیرترین و هزینه برترین مراحل قبل از PCR می باشد که با حذف آن در برخی شرایط می توان در زمان و هزینه صرفه جویی کرد. هدف از این مطالعه مقایسه دو روش  PCR مستقیم و PCR با استخراج DNA الگو  در شناسایی ژن های tst و mecA و femA ی باشد.

روش کار: در این بررسی ایزوله های بالینی استافیلوکوک اورئوس با تست های بیوشیمیایی تایید شدند. سپس با روش های، PCR مستقیم از کلنی های استافیلوکوک اورئوس کشت داده شده بر روی محیط Muller Hinton agar  و PCR با DNAاستخراج شده توسط کیت استخراج برای ژنهای tst و mecA و femAمورد ارزیابی قرار گرفت. برای این کار از سه پرایمر اختصاصی برای ژنهای مورد نظر استفاده شد.

یافته ها: تکثیر ژن های tst و mecA به طول bp < /span> 326   و bp < /span> 163 توسطPCR مستقیم و PCR با DNA استخراج شده با موفقیت انجام شد که مربوط به توکسین1سندروم شوک توکسیک و مقاومت به متی سیلین می باشند. در نهایت توسط ژنهای مورد نظر سویه های مقاوم و تولید کننده توکسین شناسایی شدند. نتایج بدست آمده از نظر کمی کاملا مشابه و از نظر کیفی متفاوت بودند، که آزمون PCR با استفاده از کیت نتایج بدست امده دارای کیفیت بهتری بود.

نتیجه گیری: با توجه به نتایح بدست آمده در این بررسی، برای صرفه جویی در وقت و هزینه در تشخیص استافیلوکوک اورئوس می توان از PCR مستقیم استفاده کرد . کیفیت باندهای بدست آمده در این روش نسبت به PCR با DNA استخراج شده، قابل قبول بود و در برخی موارد می توان از آن بعنوان یک تست تشخیصی سریع استفاده کرد. برای اینکه کیفیت کار بهتر شود باید از روغن های معدنی استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Comparison of direct PCR and PCR using DNA extracted kit for determine tst and mecA genes in Staphylococcus aureus

نویسندگان [English]

  • hamed tahmasebi
  • mohammad bokaeian
  • mojdeh jahantigh
  • javad adabi

چکیده [English]

Abstract

 Introduction: PCR reactions one of the most accurate and most sensitive tests for the molecular assays. DNA extraction always is time-consuming and costly before the PCR process, which in some cases removed can be saving time and Price. The aim of this study was to compare direct PCR and PCR with DNA extraction template for detection of tst, mecA and femA gens.

Materials and Methods: In this study, clinical isolates of Staphylococcus aureus were confirmed by biochemical tests. Then, with direct PCR by colony acquired of Muller Hinton agar culture and PCR with the extracted DNA extraction kit were studied for tst and mecA genes. For this test, three specific primers were used to target genes.

Findings: amplification was observed of tst, mecA and femA gens with length 326bp, 163bp and 132bp by direct PCR and PCR with the extracted DNA relevant to toxic shock syndrome toxin 1 and are resistant to methicillin. Finally, detected resistant strains and toxins strains by genes. Our   results quantitatively Similar each other and in therm of qualitatively were different. The results of PCR test with using extraction kit obtained the better quality.

Conclusions: According to the results obtained in this study, to save time and cost in the detection of Staphylococcus aureus can be used to direct PCR. Bands quality obtained in this way to PCR, DNA, is acceptable and in some cases it can be used as a rapid diagnostic test. To make the better quality must be used mineral oils.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Staphylococcus aurous
  • MRSA
  • Direct PCR
  • tst
  • mecA
Reference 1. Psifidi A, Dovas CI, Banos G. A comparison of six methods for genomic DNA extraction suitable for PCR-based genotyping applications using ovine milk samples. Molecular and cellular probes. 2010;24(2):93-8. 2. Kanagal-Shamanna R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods in molecular biology. 2016;1392:33-42. 4. Innis M, Gelfand D. 1 - Optimization of PCR: Conversations between Michael and David. In: Sninsky maihgj, editor. PCR Applications. San Diego: Academic Press; 1999. p. 3-22. 5. Zeng S, Liu Y, Wu M, Liu X, Shen X, Liu C, et al. Identification and validation of reference genes for quantitative real-time PCR normalization and its applications in lycium. PloS one. 2014;9(5):97039. 6. Hrstka R, Kolarova T, Michalova E, Vojtesek B. Development of PCR methods and their applications in oncological research and practice. Klinicka onkologie : casopis Ceske a Slovenske onkologicke spolecnosti. 2014;27 Suppl 1:S69-74. 7. Bartlett JM, Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2003(9);226:3-6. 8. Terpe K. Overview of thermostable DNA polymerases for classical PCR applications: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied microbiology and biotechnology. 2013;97(24):10243-54. 9. Belgrader, P., Benett, W., Hadley, D., Richards, J., &amp;amp; al, e. (1999). PCR detection of bacteria in seven minutes. Juornal of Science, 284(13), 449-50 10. Tashiro M, Izumikawa K, Ashizawa N, Narukawa M, Yamamoto Y. Clinical significance of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci obtained from sterile specimens. Diagnostic microbiology and infectious disease. 2015;81(1):71-5. 11. Ouchenane Z, Smati F, Rolain JM, Raoult D. Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in Algeria. Pathologie-biologie. 2011;59(6):129-32. 13. Shimizu T, Yamamoto Y, Hosoi T, Kinoshita K, Tokuda Y. MRSA toxic shock syndrome associated with surgery for left leg fracture and co-morbid compartment syndrome. Journal of Acute Disease. 2014;3(1):82-4. 15. Chum, P. Y., Haimes, J. D., André, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification. J. Vis. 2012;10(67): 3791-3844 16. Mehrotra M, Wang G, Johnson WM. Multiplex PCR for Detection of Genes for Staphylococcus aureus Enterotoxins, Exfoliative Toxins, Toxic Shock Syndrome Toxin 1, and Methicillin Resistance. Journal of Clinical Microbiology. 2000;38(3):1032-5. 17. Capoluongo E, Giglio A A, Lavieri MM, Lesnoni-La Parola I, Ferraro C, Cristaudo A, et al. Genotypic and phenotypic characterization of Staphylococcus aureus strains isolated in subjects with atopic dermatitis. Higher prevalence of exfoliative B toxin production in lesional strains and correlation between the markers of disease intensity and colonization density. Journal of Dermatological Science. 2001;26(2):145-55. 18. Borst P. Genetic Mechanisms of Drug Resistance: A Review. Acta Oncologica. 1991;30(1):87-105. 19. Humphreys H. Role of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin in systemic staphylococcus aureus infection. Infectious Diseases Newsletter. 1993;12(3):17-20. 20. Quan L, Morita R, Kawakami S. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) antibody levels in Japanese children. Burns. 2010;36(5):716-21. 22. Quirk M. First VRSA isolate identified in USA. The Lancet Infectious Diseases. 2002;2(9):510. 23. Ahsani MR SBM. Compare of two methods of direct PCR and PCR with DNA extraction in Clostridium Perfringens typing. Iranian Veterinary Journal. 2012;8(4):5-12. 25. Lichtensteiger CA, Steenbergen SM, Lee RM, Polson DD, Vimr ER. Direct PCR analysis for toxigenic Pasteurella multocida. Journal of Clinical Microbiology. 1996;34(12):3035-9. 26. Nakao H, Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. Journal of Clinical Microbiology. 1997;35(7):1651-5. 27. Fode-Vaughan K.A., Maki J.S., Benson J.A.and Collins M.L.P. Direct PCR detectionof Escherichia coli O157:H7. Letters in Applied Microbiology. 2003;37(7): 239-243. 28. Inglis GD, Kalischuk LD. Use of PCR for direct detection of Campylobacter species in bovine feces. Applied and environmental microbiology. 2003;69(6):3435-47. 29. van Hal SJ, Stark D, Lockwood B, Marriott D, Harkness J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) detection: comparison of two molecular methods (IDI-MRSA PCR assay and GenoType MRSA Direct PCR assay) with three selective MRSA agars (MRSA ID, MRSASelect, and CHROMagar MRSA) for use with infection-control swabs. J Clin Microbiol. 2007;45(8):2486-90. 30. Nishimura N., Nakayamaa H., Yoshizumib S., Miyoshib M., Tonoikea H., Shirasakia Y. andet al.. Detection of noroviruses in fecalspecimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods, Journal of Virological Methods. 2009; 163(2): 282-286.
مجله علوم پزشکی پارس
دوره 14، شماره 3 - شماره پیاپی 37
مهر 1395
صفحه 43-51