نویسندگان
1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
2 دانشیار ژنتیک مولکولی، بخش هپاتیت، ایدز و ویروس های منتقله از خون، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران
3 دانشیار ،بخش هپاتیت،ایدزو ویروس های منتقله از خون، انستیتوپاستور ایران،تهران، ایران
4 دانشیار ژنتیک مولکولی،دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات،تهران، ایران
چکیده
مقدمه: پروتئین تنظیمی Nef و همچنین پروتئین های ساختاری MPER و V3 ویروس HIV-1 از اهداف مهم در مطالعات واکسن به شمار می روند. از این رو در مطالعه حاضر، پروتئین فیوژن Nef-MPER-V3 در سیستم بیانی پروکاریوتی کلون و بیان شد تا به عنوان کاندید مناسب در مطالعات آتی واکسن مورد ارزیابی قرار گیرد.
روش کار: توالی ژن Nef-MPER-V3 سنتز و توسط آنزیم های NotI /HindIII به داخل وکتور pET-28a الحاق شد. سپس، بیان پروتئین نوترکیب در سیستم بیانی BL21(DE3) انجام شد. به منظور بهینه سازی بیان، فاکتورهایی نظیر زمان القاء، غلظت IPTG و دانسیته نوری (OD) مورد ارزیابی قرار گرفت. پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون Ni-NTA agarose تخلیص و با استفاده از SDS-PAGE 12% ارزیابی شد و نهایتا، توسط وسترن بلات تایید شد.
یافته ها: ژن هدف با موفقیت در وکتور بیانی کلون شد. بهترین شرایط بیان شامل: 2 میلی مولار IPTG، کدورت نوریOD600nm=0.7 و رشد به مدت پنج ساعت پس از القاء تعیین شد. پروتئین نوترکیب به وسیله کروماتوگرافی تمایلی تحت شرایط دناتوره و با استفاده از اوره با غلظت حدود 300 میکروگرم در میلی لیتر تخلیص شد. پروتئین فیوژن تخلیص شده به صورت یک باند واضح حدود 35 کیلودالتون در SDS-PAGE مشاهده و با استفاده از آنتی بادی ضد Nef در وسترن بلات آشکار شد.
نتیجه گیری: نتایج نشان داد که پروتئین نوترکیب NEF-MPER-V3 در سیستم بیانی BL21 (DE3) به خوبی بیان شده و پروتئین تخلیص شده قابلیت استفاده در آزمایش های آتی به منظور ارزیابی ایمنوژنسیتی آن در موش که در حال انجام می باشد را دارد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Cloning, Optimization of Expression Condition and Purification of the Recombinant Nef- MPER-V3 Protein of HIV-1 in Prokaryotic Expression System
نویسندگان [English]
1 MSc, Department of Biology, Sciences and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Associate prof., Department of Hepatitis, AIDS and Blood borne diseases, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3 Associate prof., Department of Hepatitis, AIDS and Blood borne diseases, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
4 Associate prof., Department of Biology, Sciences and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Introduction: Neff regulatory protein as well as structural proteins such as MPER and V3 of HIV-1 is important targets in vaccine studies. Therefore, in the current study, the Nef-MPER-V3 fusion protein was cloned and expressed in prokaryotic expression system that will be evaluated as a candidate for future vaccine studies.
Materials and Methods: The Nef-MPER-V3 sequence was synthesized and inserted into pET-28a(+) vector using Not I/HindIII enzymes. Then, the recombinant construct was expressed in BL21 (DE3) strain of E.coli. For optimization of protein expression, several factors such as time of induction, IPTG concentration and optical density (OD) were evaluated. The recombinant protein was purified on a Ni-NTA agarose column and analyzed by 12% SDS-PAGE. Finally, the fusion protein was confirmed by western blotting.
Results: The target gene was successfully cloned into the recombinant vector. The best condition for the expression such as; 2 m IPTG, OD600 = 0.7 and growth 5 hours post-induction were determined and the recombinant protein was purified by affinity chromatography in denaturing condition with urea at a concentration of about 300 μg/ ml. The purified fusion protein migrated as a clear band of around 35 kDa in SDS-PAGE and was detectable using anti-Neff antibody in western blotting.
Conclusion: Our results showed that the Nef-MPER-V3 protein was successfully expressed in prokaryotic system and purified protein may provide the antigen for future experiments for immunogenicity evaluation in mice is currently undertaken.
کلیدواژهها [English]